Western Blot中的内参归一化是WB实验结果处理中的一个必要步骤，可让您准确比较特定数据集中各个数据点之间的差异。有多种方法可以内参归一化您的Western Blot数据，理论上，各种内参归一化方法应该为您提供相同的期望结果。无论使用哪种方法，任何良好的内参归一化技术的标准都是建立一个线性信号响应区域：很简单，信号的增加与样品中所含蛋白质的量成线性比例。
评估Western Blot时有两种内参归一化方法：内参蛋白和总蛋白归一化。
目前，最常见的方法是使用看家蛋白归一化。看家蛋白在样本中的丰度可以作为整个蛋白质群体的代表。这种方法成功的关键是将内参归一化建立在可以充当内标的蛋白的基础上。也就是说，您的看家蛋白不会成为您的目标，但它仍然应该普遍存在并在您的样本中持续表达。幸运的是，由于看家蛋白的性质，它们的抗体很容易获得，并且检测普遍存在的蛋白质也很容易。
但是，使用单一看家蛋白内参存在局限性。必须分别建立阳性和阴性对照，测试不同样品中一致的蛋白表达水平，并且需要在一系列上样量范围内确认线性信号响应。所有这些都是必要的，但耗时耗力。
然而，使用总蛋白质内参归一化时，样品中的所有蛋白都是可视化的，并且它们的总丰度作为内参归一化的基础。看家蛋白内参归一化已经使用了 30 多年。 但是，总蛋白内参归一化通常被证明是更准确的选择。
归一化的目的是考虑到由于实验误差而产生的每个样品总蛋白的差异。还有什么比实际测量每个样品的总蛋白质丰度更好的方法来测量这种差异呢？总蛋白内参归一化是通过可逆染色、不可逆染色或Stain-Free（免染色）方法来完成的。免染总蛋白内参归一化是一种比较独特的方法。
Stain-Free免染技术不需要对凝胶进行染色，因此命名；但是，凝胶及印迹膜通过荧光可视化。Bio-Rad 开发的Stain-Free流程避免了对免疫检测的干扰，使其方便的应用内参归一化。单个凝胶和印迹可以作为免染色总蛋白内参归一化中所有对照实验的基础。此外，Stain-Free总蛋白还具有优异的线性响应动态范围。
比较Stain-Free和看家蛋白质内参归一化方法之间的蛋白质条带相对强度. Stain-free ; actin ; GAPDH ; tubulin ; quantitative response.
Stain-Free技术的价值在于，它使科学家能够在凝胶和印迹中以低背景可视化强的总蛋白信号，而如果没有额外的染色步骤，这是其他方法很难实现的。
在Western Blot领域，内参归一化只是一个开始。实验中，还需对靶蛋白表达水平进行定量并对照内参归一化强度进行检查。但是，一旦数据生成，内参的选择也会影响您是否计算出有意义的结果。所以，内参的选择在实验一开始前就需要做通判考虑。
考虑到所有这些信息，更多出版物依赖于总蛋白质内参归一化也就不足为奇了。一些期刊经常公开表示，在他们喜欢的Western Blot内参归一化方法中，总蛋白技术位居榜首。
