技术支持
广州市迅益生物科技有限公司
technical support

实验技术 - Real time PCR

RT-PCR 原理的话简单来说,就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪 PCR 产物,做到全程监控,后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。步骤如下:

RNA 提取和测定 


1. 平衡:-80℃ 取出 TRIZOL 裂解的细胞(也可以当时裂解;如果是组织,需要超声破碎后再进行后续步骤),置于室温使其完全溶解(3-5 min 左右); 


2. 分离:随后按照裂解液:氯仿(5:1)的比例加入氯仿,剧烈震摇 30 S(自认为手劲儿大的就手动摇,扛不住的话也可以涡旋仪,当然我是一直手动的哈哈)后,室温静置 3 min,4℃,13,000rpm 离心 10 min,取上清置于干净的 RNAfree 的 EP 管中。【小提示:取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出,导致蛋白质污染,可以采用 PhaseLock Gel 的离心管,有效分层水相和有机相,避免吸取的上清混杂杂质。】 


3. 沉淀:在上清中加入等体积的异丙醇,轻微上下翻动混合,冰上孵育 20 min 后,4℃,14,000rpm 离心 20 min,管底部有可见沉淀,即为 RNA(如果裂解的细胞较少,沉淀可能肉眼看不见)。


 4. 清洗干燥:轻柔的倒掉上清,每管加入 1 ml 75% 乙醇溶液(采用 DEPC 水配置),混匀,4℃,14,000 rpm 离心 15 min。小心倒掉上清,于超净台边缘干燥 5 min。


 5. 溶解测定:根据具体的 RNA 的量,加入适当的 DEPC 水溶解(沉淀可见,加入的 DEPC 水多一些,反之少加),静置后即可于 nanodrop 检测浓度(一般我们暂定 A260/A280 比值在 1.8-2.0 即可使用)。


cDNA 合成 


虽然步骤看似较多,但是掌握后还是蛮简单的,而且在做该步骤的时候还可以穿插很多其他的实验,非常不占用时间。 在小笔的实验中,采用的是 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix 试剂盒,只需要根据试剂盒说明书的配比加入八连排管,设置好程序即可。 当然,每个实验室使用的试剂盒不同,具体根据各自实际情况来定,但是原理是相同的,最终得到 cDNA 产物即可,储存于 -20℃ 备用。



RT-PCR

 

这部分其实是最简单也是最难的一步,简单在于只要把相应的引物,cDNA 产物,SubGreen 染料等以合适的比例混合在一起即可;而难点在于加样的精准性,会极大的影响实验的结果。 我以 ABI 7500fast 为例:

反应温度为:95℃ 预变性 3 min, 随后 40 个 PCR 循环(95℃ 3 seconds;60℃ 31 secends),最后加上溶解曲线即可